转抗菌肽基因的柑桔遗传转化研究

柑桔是我国最重要的果树树种之一，绝大部分产区流行的柑桔溃疡病给柑桔业带来巨大的损失。柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌能力，我们的预备试验表明，它对柑桔溃疡病病原菌Xanthomonas campestris pv. Citri有很强的抑菌效应，本文报道以柞蚕抗菌肤基因转化柑桔的一些结果。根癌农杆菌菌株SE的质粒载体含卡那霉素(Km)抗性基因、胭脂碱(NoPaline)合成酶基因和人工合成的122bp柞蚕抗菌肤D基因。取10-15天龄锦橙(Citrus sinens Osbeek.)试管实生苗的子叶(切成约1cmxIcm方块)、上胚轴和下胚轴(约1cm长的切段)浸于28℃培养过夜的农杆菌菌液(稀释5-10倍)10分钟，而后以无菌滤纸吸干菌液，在MS培养基上共培养3天后转入含500mg/L羧苄青霉素(Cb)的MS培养基中除菌，3-5天后再将其转移到含75mg/L Km、50omg/L Cb及不同浓度BA、IAA的MS培养基上培养，10-15天时外植体切口处开始有抗性芽产生；继代2次后(在含Km培养基上培养共50天)统计，附加2mg/L BA、0.25mg/L IAA、75mg/L Km和500mg/L Cb的MS培养基中，从子叶获得抗性芽的频率为26.5%，上、下胚轴分别为29.4%和3.2%，在含5mg/L BA、75mg/L Km和500mg/L Cb培养基上，子叶、上胚轴、下胚轴的诱芽频率分别为36.1%、41.2%和4.1%，可见下胚轴不适于用作转化外植体。带小芽外植体或切离的小芽继续在原培养基上继代或转入附加1mg/L BA、1mg/L GA及75mg/L Km的培养基，抗性芽均无明显伸长；随着继代次数增加，抗性芽生根能力逐渐下降。将1cm左右的芽切下，在含0.5mg/L NAA、75mg/L Km的1/2MS培养基和附加0.5mg/L BA、1mg/L NAA、75mg/L Km、0.4%活性碳的MS培养基上诱根，生根率分别为19.2%和30.1%；正采用其他技术(如试管嫁接)提高成株率。参照Otten等的方法，以移栽或嫁接到花盆中的拟转化植株叶片提取物进行纸电泳，部分植株可检测到Nopaline，正待进一步进行分子生物学鉴定。