柑橘体细胞杂种细胞遗传学及抗CTV等基因对枳的FISH分析

柑橘体细胞杂种为砧木和接穗品种改良提供了丰富的材料。原位杂交技术是对杂种染色体组成进行鉴别和对基因进行染色体物理定位的一种非常有效的分子细胞遗传学技术。本实验对已开花柑橘体细胞杂种及其亲本的花粉母细胞染色体减数分裂行为以及花粉育性进行了研究；完善了适用于柑橘材料的基因组原位杂交技术，对6例柑橘属间有性或体细胞杂种的核基因组组成进行了分析；并应用FISH技术对抗CTV、rDNA、copia-like反转录转座子、多聚半乳糖醛酸酶(PG)等基因在枳染色体上的物理定位进行了研究。主要研究结果如下: 1 采用花粉母细胞酶解压片法，观察了6个柑橘体细胞杂种及其5个亲本的花粉母细胞染色体减数分裂行为，发现柑橘异源四倍体体细胞杂种减数分裂较其亲本复杂。体细胞杂种中染色体同源配对构型多样，单价体与多价体出现比例高，染色体排在赤道板外，后期形成染色体桥以及染色体落后等异常行为频率较高。但印度酸橘与阿根廷枳(Citrus reticulata+Poncirus trifoliata)属间组合例外，其减数分裂正常，染色体同源配对构型为二价体，类似于二倍体，且少有染色体异常行为。二倍体胞质杂种佩奇橘柚-粗柠檬[(C. reticulate×C. paradisf)+C. jambhiri]减数分裂中的染色体行为比其亲本出现了更多异常现象。 2 对8个体细胞杂种和6个亲本的正常四分体比例、小花粉比率、花粉染色活力、体外萌发率以及芘粉粒大小进行观察统计，分析其花粉育性，发现柑橘异源四倍体体细胞杂种的小花粉比率显著高于融合亲本，花粉萌发率介于双亲之间。异源六倍体体细胞杂种锦橙+HR [C.sinensis+(C.sinensis+C.jambhiri)]和二倍体胞质杂种佩奇橘柚-粗柠檬[(C.reticulata×C.paradisi)+C.ambhiri]的花粉萌发率分别为3.7%和6.8%，低于各自双亲。 3 优化了柑橘基因组原位杂交的技术条件。采用去壁低渗-火焰干燥法获取染色体制片，切口平移法标记探针，点印渍法检测探针标记效果，煮沸方法打断封阻总DNA，探针与封阻DNA的浓度比例为1:50时，能有效地分开属间有性杂种枳橙和枳柚中来自双亲的染色体。 4 以枳总DNA为探针，对甜橙染色体进行GISH分析，检测枳(P.trifoliata)与甜橙(C.sinensis)基因组之间的同源性，结果显示甜橙中有5对染色体与枳基因组存在较高的同源性。 5 采用GISH技术分析4个组合的柑橘属间四倍体体细胞杂种的核遗传组成，结果表明体细胞杂种的核基因组中双亲染色体各占一半，在拘头橙+积(Cuaarntui胡+prt扣liaQt)组合中还检测到来自不同亲本的2对染色体发生了易位，说明体细胞杂交后双亲基因组有遗传重组行为。另外，在红橘十积(cerctiualat+p介扣aliat)组合中，还发现少量三倍体体细胞(2n=3x=27)，GISH技术显示这些三倍体体细胞丢失了一套来自亲本红橘的染色体.6提取枳的Cot-1DNA作为探针，与积的中期染色体进行FISH分析，结果表明Cot-1DNA在积全部染色体上都有分布，但主要集中于染色体的端部，说明异染色质区的重复序列是Cot-1DNA的主要成分。7分别以含抗CVT基因的大片断克隆TAC、BAC以及ps8质粒为探针，对抗CVT基因在积染色体上进行了物理定位。FISH检测出抗CTV基因位于第3染色体的长臂，距着丝粒的百分距离平均为87.8土22。以大片断克隆为探针的FISH检出率大大高于小片段插入的质粒探针的检出率，混合标记TAC、BAC克隆的检出率更高。但是，以大片断克隆为探针的FISH需要Cot-1DNA作封阻。8特异扩增出455和552个rDNA基因片断，对这2个rDNA基因在积中期染色体上进行了FISH介析。结果表明455rDNA在枳染色体上存在6个位点，显示了3对NOR；枳染色体上存在2个55DrNA位点，位于4号同源染色体的短臂。9以反转录转座子copia-like基因作为探针，应用FISH在枳中期染色体上进行了物理作图。杂交信号表明反转录转座子copia-like基因呈簇状分布于11条枳染色体的端部，其中6条染色体的端部区域所分布的copia-likei基因拷贝数较多，3条染色体端部的拷贝数次之，其余2条染色体分布的copia-like基因拷贝数最少。10采用PCR技术从红肉脐橙(C. sinensis)中分别分离克隆出PG同源基因的2条cDNA及对应的2条总DNA片断。2条cDNA分别长574bp、650bp，对应的总DNA分别为775bp、1818bp。编码的氨基酸序列与其他植物的相应区域氨基酸序列同源性为80%-93%。采用FISH将PG基因对枳进行了染色体物理定位。检测出PG基因位于第5染色体的长臂上，信号