TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪脂蛋白酯酶mRNA方法的建立

【目的】克隆猪cDNA,作为猪LPLmRNA定量检测的标准品,建立检测方法。 【方法】用RT-PCR,从猪背最长肌的总RNA中逆转录扩增LPL的cDNA,将纯化的LPLcDNA与pGM-T载体进行连接,转化宿主菌TOP10,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析,对质粒标准进行实时荧光定量PCR检测。纯化质粒并检测260nm吸光度,确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。 【结果】建立了猪LPLmRNA实时定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达103拷贝,线性范围为1×103～1×1010拷贝,阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系(R2=0.9871)。 【结论】成功克隆了LPL实时荧光PCR定量标准,且TaqMan荧光定量RT-PCR的方法可对猪背最长肌LPLmRNA的表达进行准确定量。