转基因调控柑橘类胡萝卜素积累的细胞学和代谢研究

类胡萝卜素是植物生存必需的次生代谢类物质,参与众多的生物学过程,如光合作用、抗氧化保护、激素合成以及传粉等。类胡萝卜素也是人类健康所必需的生物活性成份,如提供维生素A前体,抗氧化和衰老,降低心血管疾病风险,以及参与人体免疫、胚胎发育和生殖等。植物是自然界中类胡萝卜素合成的主要生物体,也是人体中类胡萝卜素的最主要来源。因此,研究植物类胡萝卜素代谢调控机制是有效利用类胡萝卜素的重要基础。 柑橘中含有丰富多样的类胡萝卜素资源,是植物类胡萝卜素代谢研究的极好材料。本研究通过创制多种柑橘材料,包括转基因胚性愈伤和植株,以及夏橙DH系,深入分析了柑橘类胡萝卜素代谢调控特征、类胡萝卜素代谢同其他生物学过程的关系,以及甜橙中两个类胡萝卜素合成关键基因的等位多态性。主要研究结果如下： 1.转CrtB和DSM2基因调控柑橘胚性愈伤中类胡萝卜素积累的研究 (1)利用CrtB(来源于细菌的八氢番茄红素合成酶基因)转化马叙葡萄柚(Citrus paradise Macf.)、星露比葡萄柚(Citrus paradise Macf.)、红肉脐橙[Citrus sinensis (L.)Osb.]和日辉杂柑[Citrus reticulata Blanco×(Citrus paradisi Macf.×Citrus Reticulate)]4种基因型的柑橘胚性愈伤组织,创制了一批具有多种类胡萝卜素积累特征的细胞系(ECMs, Engineering Cell Models)。表型观察和HPLC分析表明,ECMs中的类胡萝卜素含量显著高于野生型,而类胡萝卜素的积累模式受基因型影响呈现多样性。在ECMs中检测到30种自由态类胡萝卜素,其中包括野生型含有的所有类胡萝卜素和一些新出现的种类,如番茄红素等。 (2)与野生型不同,ECMs中的类胡萝卜素积累具有明显的β路径优势,表现为丰富的p-胡萝卜素积累特征。特别是在暗培养条件下,ECMs的p路径优势更为明显。基于所获数据,本研究提出一种模型用于解释ECMs中出现的p路径优势。该模型认为上游类胡萝卜素的合成能力和LCYE(番茄红素ε环化酶)的瓶颈作用是导致p路径优势的主要原因。 (3)在光照条件下,ECMs中的β-胡萝卜素和八氢番茄红素含量显著减少,而叶黄素含量变化不显著。37℃条件下,ECM中多数类胡萝卜素的积累量同样表现出显著的降低趋势,但玉米黄质含量明显提高。另外,可能由于表观调控的影响,同一份ECM中存在CrtB基因表达和类胡萝卜素积累的不均一性特征。 (4)选取4种同胚性愈伤相同基因型的成熟果实有色层组织作为类胡萝卜素积累的自然参比。本研究首先分析了ECMs同有色层组织间的类胡萝卜素积累差异。结果表明,有色层中主要积累紫黄质和隐黄质,并多以酯化形式存在；或者以积累番茄红素为主。此外,ECMs和有色层细胞的质体发育形式不同,在ECMs中类胡萝卜素主要以晶体形式存储于淀粉体中;而在有色层细胞中,类胡萝卜素存储于有色体。本研究在ECMs液泡中观察到富含类胡萝卜素的聚集体,这一现象暗示可能存在一种新的类胡萝卜素降解途径。 (5)转录分析表明,有色层中类胡萝卜素代谢相关基因的转录水平普遍高于愈伤,特别是HYD(β-胡萝卜素羟化酶基因)具有显著的有色层特异性表达特征,而在愈伤中被抑制。进一步通过CrtB和DSM2(来源于水稻的HYD基因)共表达分析证实,HYD是控制两种组织间类胡萝卜素积累差异的主要位点。在共表达体系中,观察到β-胡萝卜素含量同类胡萝卜素晶体大小显著正相关,这一特征表明类胡萝卜素晶体主要由β-胡萝卜素构成。另外,ECMs中存在内源类胡萝卜素代谢相关基因的表达波动,其中在星露比葡萄柚的转CrtB基因愈伤系中最为明显。 2.类胡萝卜素积累对质体发育和代谢的影响 (1)在转CrtB基因柑橘愈伤系(ECMs)中,淀粉含量显著低于野生型,而可溶性糖含量高于野生型。这些特征表明,类胡萝卜素积累影响了愈伤组织中的碳水化合物代谢,并且暗示ECMs中存在潜在的有色体发育过程。进一步通过糖饥饿处理证明,ECMs中确实存在有色体发育,只是在正常条件下淀粉的优势积累抑制了ECMs中有色体的形成。 (2)本研究利用柑橘芯片分析了4组ECMs同野生型间的转录谱差异。结果表明,4组材料间存在类似的差异基因响应模式。其中最主要的特点是,大量逆境和氧化还原响应相关基因在ECMs中上调表达,如POD(过氧化物酶基因)、GST(谷胱甘肽S转移酶基因)、HSP(热激蛋白基因)和苯丙烷代谢相关基因等。另外,本研究检测到花青素代谢相关基因在ECMs中呈现下调表达趋势,这一特征暗示类胡萝卜素积累负调控花青素合成。在ECMs中,检测到一个直接参与淀粉降解的α-淀粉酶基因呈上调表达趋势,它可能是影响柑橘愈伤组织中淀粉含量变化的重要原