紫杉醇合成途径中紫杉烯合成酶cDNA的克隆

【目的】研究紫杉烯合成酶超表达对紫杉醇代谢的影响,以提高红豆杉属植物细胞中紫杉醇的含量。 【方法】从南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)愈伤组织提取总RNA,根据已发表的中国红豆杉紫杉烯合成酶cDNA序列设计两对引物,通过RT-PCR技术扩增出该酶5′端长度为1 201 bp和3′端长度为1 388 bp的两个cDNA片段,将其克隆到pGEM-T Vector上并转化到E.coli DH5α中,5′端片段经XbaⅠ和BglⅡ双酶切鉴定,3′端片段经BglⅡ和SacⅠ双酶切鉴定后,对阳性克隆进行序列测定。两片段与双元载体pCAMBIA1300-35S::GUS以T4 DNA连接酶连接并转化到E.coli DH5α中,经XbaⅠ和SacⅠ双酶切鉴定。 【结果】测序结果证实确为紫杉烯合成酶基因,酶切结果证实紫杉烯合成酶cDNA全长连接成功并插入到pCAMBIA130035S::GUS中。 【结论】两cDNA片段拼接得到全长2 589 bp的紫杉烯合成酶基因,编码862个氨基酸,与中国红豆杉紫杉烯合成酶基因具有98%的同源性;成功构建了pCAMBIA130035S-TS载体,为下一步的转基因工作做好了准备。