农杆菌介导的CMV侵染性克隆及2b缺失突变体构建

【目的】构建农杆菌介导的黄瓜花叶病毒(CMV)侵染性克隆,测试缺失CMV 2b基因后的侵染表型。 【方法】首先将pHST40上的1x35S-MCS-HDVRZ-NOS转移到中间载体pBluescript SK Ⅱ上,用pRTL2上的2x35S替换中间载体上的1x35S增强子序列,然后将2x35S-MCS-HDVRZ-NOS转移到微型植物表达载体pCB301,构建适用于病毒侵染性克隆和农杆菌浸润的植物表达载体,在此基础上将CMV Fny株系的全长cDNA基因组构建到该植物表达载体的2x35S启动子和HDV核酶之间,通过农杆菌浸润在本氏烟中瞬时表达产生具有侵染活性的CMV基因组RNA,进一步缺失2b来测试该缺失突变体侵染植物的表型。 【结果】构建了一个用于构建RNA病毒侵染性克隆的植物表达载体pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-NOS,将CMV Fny的3条基因组分别构建在这个植物表达载体上后,通过农杆菌浸润本氏烟可诱导产生曲叶、花叶和矮化等症状,进一步对2b进行缺失,表明该缺失突变体接种本氏烟早期具有微弱曲叶症状,中后期表现无症,RT-PCR检测表明CMV Fny 2b缺失突变体能够系统侵染本氏烟。 【结论】在改造的微型植物表达载体pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-NOS上构建了CMV的侵染性克隆,构建的侵染性克隆通过农杆菌介导可快速高效侵染植物。2b对CMV Fny在本氏烟中的症状发展具有重要作用,但2b对其在本氏烟上的复制和系统侵染并不是必需。